Untangling chromatin: investigating the role of transcription, supercoiling and topoisomerases in genome organization

Abstract

La organización del genoma en células mamíferas sigue siendo en gran parte desconocida. Un nivel fundamental de organización se considera el bucle de cromatina, que consiste en una región de ADN atrapada en el interior de un complejo cohesina en forma de anillo, a menudo flanqueado por dos proteínas aislantes CTCFs. Aún se está investigando cómo se forman, mantienen y regulan estos bucles. Investigamos si la ARN polimerasa II es una fuerza impulsora para la translocación de cohesina en la cromatina. Mostramos que el superenrollamiento generado por la transcripción contribuye a la formación de bucles de cromatina y mejora la movilidad de la cohesina. Además, desarrollamos nuevos métodos sólidos para cuantificar cambios morfológicos en la cromatina dentro de las células utilizando microscopía confocal y de superresolución. Finalmente, investigamos en células individuales vivas el comportamiento de las enzimas que controlan la topología y el superenrollamiento del ADN: las topoisomerasas. En resumen, en este trabajo de tesis, estudié la relación entre la organización genómica, la transcripción y el superenrollamiento, y desarrollé enfoques novedosos para el análisis de la cromatina en células humanas.Genome organization in mammalian cells remains still largely unknown. One fundamental level of organization is considered the chromatin loop, consisting in a region of DNA entrapped in the lumen of a ring-shaped cohesin complex, often flanked by two CTCFs insulating proteins. Still, how loops are formed, maintained, and regulated is yet under investigation. We investigated whether RNA polymerase II is a driving force for cohesin translocation on chromatin. We showed that supercoiling generated by transcription contributes to chromatin looping and enhances cohesin mobility. In addition, we developed robust new methods for quantifying morphological changes in chromatin within cells using confocal and super-resolution microscopy. Finally, we investigated in living single cellsthe behavior of the enzymes controlling DNA topology and supercoiling: topoisomerases. Overall, in this thesis work, I studied the relationship between genomic organization, transcription, and supercoiling, and developed novel approaches for the imaging analysis of chromatin in human cells.Programa de Doctorat en Biomedicina