Modulation-enhanced localization microscopy: using patterned illumination for super-resolution microscopy: from the localization of single molecules to the descripton of nano-structures

Abstract

This thesis introduces SIMPLE (Structured Illumination based Point Lo- calization Estimator), a novel super-resolution technique in fluorescence microscopy. By combining standing-wave patterned illumination with single-molecule localization microscopy (SMLM), SIMPLE achieves sig- nificant improvements in localization precision. Experimental results demonstrate a 2-fold enhancement in localization precision over a 400 μm2 field of view, validating the practical effectiveness of SIMPLE. Additionally, this thesis presents meLM (Modulation-Enhanced Lo- calization Microscopy) as a broader concept that encompasses techniques like MINFLUX, SIMPLE, and others. The simulations conducted in this study confirm the theoretical predictions of SIMPLE’s improved local- ization precision throughout the field of view. Furthermore, the thesis proposes an extension of SIMPLE for direct size measurement of sparse nano-structures, which has the potential to overcome limitations imposed by SMLM. Although actual size measure- ments have not been performed, this proposal highlights the promising application of SIMPLE in nano-structure sizing experiments. In summary, SIMPLE demonstrates the power of patterned illumi- nation in advancing super-resolution imaging. The thesis establishes SIMPLE as a key technique within the broader framework of meLM, and suggests its potential for precise nano-sizing experiments.

Esta tesis presenta SIMPLE (Estimador de Localización Puntual basado en Iluminación Estructurada), una nueva técnica de superresolución en microscopía de fluorescencia. Al combinar la iluminación con ondas es- tacionarias patroneadas y la Microscopía de Localización de Moléculas Únicas (SMLM), SIMPLE logra mejoras significativas en la precisión de localización. Los resultados experimentales demuestran un incremento de 2 veces en la precisión de localización sobre un campo de visión de 400 μm2, validando la efectividad práctica de SIMPLE. Además, esta tesis presenta meLM (Microscopía de Localización Me- jorada por Modulación) como un concepto más amplio que abarca téc- nicas como MINFLUX, SIMPLE y otras. Las simulaciones realizadas en este estudio confirman las predicciones teóricas de la mejora en la pre- cisión de localización de SIMPLE en todo el campo de visión. Además, la tesis propone una extensión de SIMPLE para la medición directa del tamaño de nanoestructuras dispersas, lo cual tiene el poten- cial de superar las limitaciones impuestas por SMLM. Aunque no se han realizado mediciones reales de tamaño, esta propuesta resalta la prome- tedora aplicación de SIMPLE en experimentos de dimensionamiento de nanoestructuras. En resumen, SIMPLE demuestra el poder de la iluminación estructu- rada en el avance de la imagen de superresolución. La tesis establece a SIMPLE como una técnica clave dentro del marco más amplio de meLM y sugiere su potencial para experimentos precisos de dimensionamiento de nanoestructuras.

Aquesta tesi presenta SIMPLE (Estimador de Localització de Punts basat en Illuminació Estructurada), una nova tècnica de super-resolució en mi- croscòpia de fluorescència. Mitjançant la combinació d’una il·luminació estructurada amb ones estacionàries i la Microscòpia de Localització de Molècules Úniques (SMLM), SIMPLE aconsegueix millores significati- ves en la precisió de localització. Els resultats experimentals demostren un increment del doble en la precisió de localització sobre una àrea de visualització de 400 μm2, validant l’efectivitat pràctica de SIMPLE. A més, aquesta tesi presenta meLM (Microscòpia de Localització Mi- llorada per Modulació) com a concepte més ampli que engloba tècniques com MINFLUX, SIMPLE i altres. Les simulacions realitzades en aquest estudi confirmen les prediccions teòriques sobre la millora en la precisió de localització de SIMPLE a tota l’àrea de visualització. A més a més, la tesi proposa una ampliació de SIMPLE per a la mesu- ra directa de les dimensions de nanoestructures disperses, la qual cosa té el potencial per superar les limitacions imposades per SMLM. Encara que no s’han realitzat mesures reals de les dimensions, aquesta proposta posa de manifest l’aplicació prometedora de SIMPLE en els experiments de mesura de nanoestructures. En resum, SIMPLE demostra el poder de la il·luminació estructurada en l’avanç de la imatge de super-resolució. La tesi estableix SIMPLE com una tècnica clau dins del marc més ampli de meLM i suggereix el seu potencial per a experiments de mesura precisa de dimensions de nanoestructures.

Programa de Doctorat en Biomedicina