dc.contributor.author |
Marco Giménez, Andrés, 1993- |
dc.contributor.other |
Montserrat Pulido, Núria |
dc.contributor.other |
Universitat Pompeu Fabra. Departament de Ciències Experimentals i de la Salut. |
dc.date.accessioned |
2023-03-16T02:32:56Z |
dc.date.available |
2023-03-16T02:32:56Z |
dc.date.issued |
2022-03-16T16:37:42Z |
dc.date.issued |
2023-03-14T23:45:29Z |
dc.date.issued |
2022-03-14 |
dc.identifier |
http://hdl.handle.net/10803/673798 |
dc.identifier.uri |
http://hdl.handle.net/10230/52713 |
dc.description.abstract |
Our current knowledge about the function of human genes is mostly based on data
from genetic studies using animal models. However, divergence among species may
hamper the understanding of genetic mechanisms underlying human specific traits.
Nowadays, an alternative to animal models stands on the generation of organ-like
cultures derived from human pluripotent stem cells (hPSCs), the so called organoids.
In the last years, the organoids have proved to recapitulate, in a high extent, the
development, multicellular architecture, and physiology of human organs. To perform
genetic studies in these valuable models, methods for rapid and controllable genetic
manipulation of hPSCs are needed. To fulfill this need, the generation of an inducible
CRISPR platform (iCRISPR) previously enabled efficient and inducible genome
editing in hPSCs. Nevertheless, iCRISPR had important limitations hampering further
transgenesis for expanding its possible applications. Based on iCRISPR, this thesis
describes the generation of a new iCRISPR2 (iC2) platform with improved versatility
for transgenesis. We generated selection-free hPSCs with monoallelic insertions of an
inducible Cas9 expression module at the AAVS1 locus. Engineered iC2 hPSCs were
then exploited for the high-throughput generation of stable and inducible KO hPSCs
lines, precise KI hPSCs lines, and a reporter hPSCs line. In addition, the iC2 platform
was repurposed for the generation of hPSCs for controlled gene regulation by
CRISPR/dCas9 systems. Finally, some stable and inducible KO hPSCs were
differentiated into kidney organoids to study the role of LHX1 and VHL in kidney
development and disease. Our results showed that LHX1 function is required for renal
vesicle formation prior nephrogenesis, as well as that VHL depletion impairs
mitochondrial respiration in tubular cells derived from kidney organoids.
On balance, iCRISPR2 technology could be applied in any hPSCs-based
differentiation model to systematically dissect gene function in human development,
physiology and disease |
dc.description.abstract |
Nuestros conocimientos sobre la genética humana se basan mayormente en datos
procedentes de estudios genéticos realizados con modelos animales. Sin embargo,
la divergencia entre especies puede dificultar la comprensión de los mecanismos
genéticos que subyacen a los rasgos específicos del ser humano. Actualmente, una
alternativa al uso de modelos animales se basa en la generación de cultivos similares
a órganos mediante la diferenciación de células madre pluripotentes humanas
(hPSCs), llamados organoides. En los últimos años, los organoides han demostrado
recapitular, en gran medida, el desarrollo, la arquitectura multicelular y la fisiología de
los órganos humanos. Para realizar estudios genéticos en estos valiosos modelos, se
necesitan métodos de manipulación genética rápida y controlable de las hPSCs. Para
cubrir esta necesidad, la generación previa de una plataforma inducible de la
tecnología CRISPR (iCRISPR) ha permitido la edición del genoma de las hPSCs de
una forma eficiente y regulable. Sin embargo, iCRISPR tiene importantes limitaciones
que dificultan procesos de transgénesis que permitan ampliar sus posibles
aplicaciones. Basada en iCRISPR, esta tesis describe la generación de una nueva
plataforma iCRISPR2 (iC2), con mayor versatilidad para la transgénesis. En este
trabajo hemos generado hPSCs libres de genes de resistencia a antibióticos y con
inserciones monoalélicas en el locus AAVS1 que permiten la expresión inducible de
la proteína Cas9. La nueva plataforma iC2 ha sido explotada para modificar con un
alto rendimiento el genoma de hPSCs e introducir así mutaciones de pérdida de
función génica (KO) estables e inducibles, mutaciones precisas y genes reporteros.
Además, la plataforma iC2 se ha re propuesto para la generación de hPSCs que
permitan la regulación controlada de genes mediante sistemas CRISPR/dCas9.
Finalmente, algunas hPSCs con mutaciones KO se han diferenciado en organoides
renales para poder estudiar el papel de genes como LHX1 o VHL en el desarrollo y la
enfermedad renal. Nuestros resultados han demostrado que la función de LHX1 es
necesaria para la formación de vesículas renales antes de la nefrogénesis, así como
que la pérdida de VHL perjudica la respiración mitocondrial en las células tubulares
derivadas de organoides renales.
En definitiva, la tecnología iCRISPR2 podría aplicarse en cualquier modelo de
diferenciación basado en hPSCs para diseccionar sistemáticamente la función de los
genes en el desarrollo, la fisiología y las enfermedades humanas. |
dc.format |
357 p. |
dc.format |
application/pdf |
dc.format |
application/pdf |
dc.language.iso |
eng |
dc.rights |
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dc.rights |
info:eu-repo/semantics/openAccess |
dc.source |
TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
dc.title |
Generation and validation of a CRISPR platform for rapid and inducible genome editing in human pluripotent stem cells and kidney organoids |
dc.type |
info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
dc.type |
info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
dc.date.modified |
2023-03-14T23:45:34Z |
dc.subject.keyword |
Células madre pluripotentes |
dc.subject.keyword |
Edició genètica |
dc.subject.keyword |
CRISPR-Cas9 |
dc.subject.keyword |
Modelatge de malalties |
dc.subject.keyword |
Organoide |
dc.subject.keyword |
Diferenciació cel.lular |
dc.subject.keyword |
Pluripotent stem cells |
dc.subject.keyword |
Genome editing |
dc.subject.keyword |
Disease Modelling |
dc.subject.keyword |
Organoid |
dc.subject.keyword |
Cell diferentiation |
dc.subject.keyword |
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