Caracterización del fenotipo muscular en la EPOC y sepsis en pacientes : estructura fibrilar, inflamación, estrés oxidativo y regeneración

Abstract

La inflamación y el estrés oxidativo son mecanismos moleculares que contribuyen al daño y a la disfunción muscular. Existen procesos crónicos con fenómenos inflamatorios de bajo grado pero de larga duración (EPOC, con o sin pérdida de peso), así como situaciones clínicas con liberación aguda de gran cantidad de moléculas proinflamatorias (Sepsis). Los mecanismos de regeneración del músculo en ambas entidades son esenciales para la correcta recuperación funcional y pueden condicionar cambios fenotípicos. Objetivo: En la EPOC, evaluar el estrés oxidativo, inflamación y estructura antes y después de un programa de rehabilitación en el vasto lateral (VL) del cuádriceps e intercostal. En dos grupos adicionales estudiar cambios regenerativos en el VL y realizar un análisis de cambios fibrilares y supervivencia. En pacientes con sepsis, investigar los eventos de estrés oxidativo e inflamación en los mismos músculos. Métodos: Estudio 1: Se analizaron cambios fibrilares (inmunohistoquímica) y estrés oxidativo (western-blot) en el músculo VL e intercostal en 25 pacientes con EPOC, antes y después de un entrenamiento de alta intensidad (8-10 semanas). En todos los pacientes se determinaron la capacidad de ejercicio (test de marcha de 6’ y cicloergómetro) y calidad de vida relacionada con la salud (cuestionarios SGRQ y SF36). Estudio 2: En un grupo adicional de 392 pacientes EPOC se analizó el fenotipo fibrilar del VL y su supervivencia. Estudio 3: Se obtuvieron muestras del VL en 15 pacientes con EPOC sin bajo peso, 15 pacientes EPOC con bajo peso y 10 sujetos control. Se analizaron cambios fibrilares, daño y número de células satélite (inmunohistoquímica), expresión de ARN de genes clave en la regeneración, mediadores de inflamación y mantenimiento de la masa muscular (PCR en tiempo real), y niveles de proteínas clave relacionadas con la regeneración (western-blot). Se obtuvieron cultivos primarios de mioblastos de dichas muestras musculares, en las que se evaluaron propiedades de migración (microscopía de tracción), capacidad de proliferación (Population doubling time y ELISA) y diferenciación (ELISA y PCR en tiempo real). Estudio 4: En el VL e intercostal de 6 pacientes con sepsis grave y 6 sujetos control se analizó la estructura muscular, células inflamatorias, estrés oxidativo y expresión de mediadores inflamatorios (técnicas mencionadas anteriormente). Resultados: Estudio 1: Situación basal, en el VL respecto del intercostal se observaron niveles de estrés oxidativo y antioxidantes (SOD2) aumentados. Tras 10 semanas de entrenamiento, se observaron mejorías en la capacidad de ejercicio y calidad de vida sin aumentos en los niveles de estrés oxidativo en ninguno de los músculos. Estudio 2: En el VL de pacientes EPOC el aumento en la proporción de fibras rápidas se asoció a una mayor mortalidad, especialmente en aquéllos con enfermedad grave. Estudio 3: En el VL de pacientes EPOC respecto de los sujetos control se observó mayor limitación al ejercicio, aumento de fibras rápidas, signos de daño, núcleos internalizados y células satélite. En los mismos pacientes se observó un incremento en la expresión de genes involucrados en fases precoces de la regeneración muscular (PAX7, MYOG y MYF6), pero descenso en los que regulan fases tardías (MYH8). Además en los pacientes con bajo peso se observó un aumento en los niveles de IL-6 y una sobreregulación en la expresión de IGF-1 y MGF en el VL. En los cultivos primarios de mioblastos no se observaron diferencias entre pacientes y controles en la capacidad de migración, proliferación, diferenciación ni en la expresión de genes clave de regeneración muscular. Estudio 4: En el VL de pacientes con sepsis los niveles de diversos marcadores de estrés oxidativo e inflamación (TNF-alfa y sus receptores, IL-1β, IL-6 y CD18) estaban aumentados, mientras que no se observaron diferencias en el músculo intercostal. Conclusiones: Se han encontrado alteraciones musculares en la EPOC y la sepsis, aunque con un patrón diferenciado entre la musculatura respiratoria y periférica en esta última. El entrenamiento de alta intensidad induce una mejoría clínica en los pacientes EPOC, sin conllevar aumento en los niveles de estrés oxidativo o inflamación. Los mecanismos de regeneración/reparación parecen hallarse alterados en el VL de pacientes con EPOC, probablemente debido a la interacción de factores locales in vivo. El fenotipo fibrilar en este músculo predice la mortalidad de dichos pacientes.

Both inflammation and oxidative stress are molecular mechanisms that contribute to muscle damage and dysfunction. Although different chronic disorders share inflammatory phenomena, some of them are characterized by a low-grade but long duration of these events (COPD, with or without weight loss) and others are more acute with a dramatic release of many proinflammatory molecules (Sepsis). The mechanisms of muscle regeneration in both entities are essential for a proper structural and functional recovery, and can condition phenotypic changes. Objective: To assess oxidative stress, inflammation and muscle structure before and after a rehabilitation program in the vastus lateralis (VL) and intercostal muscles of COPD patients. Moreover, to evaluate regenerative changes in the VL and to carry out a survival analysis. In parallel, to investigate the events of oxidative stress and inflammation in the muscles of septic patients. Methods: Study 1: fiber changes (immunohistochemistry) and oxidative stress (western-blot) were analyzed in the intercostal and VL muscles of 25 COPD patients before and after a high intensity training (8-10 weeks). Exercise capacity (6’ walking test and cycloergometry) and health-related quality of life (SGRQ and SF36) were also determined. Study 2: fiber phenotype of VL and survival was analyzed in an additional group of 392 COPD patients. Study 3: fiber changes, damage and number of satellite cells (immunohistochemistry), RNA expression of key genes involved in regeneration, mediators of inflammation and maintenance of muscle mass (real time PCR), and levels of key proteins related to regeneration (western-blot) were analyzed in the VL of COPD patients (15 underweight and 15 with normal weight) and control subjects (n=10). Primary myoblast cultures of these muscle samples were also performed and cell mechanical properties (linked to migration, tensile microscopy), proliferation (population doubling time and ELISA) and differentiation (ELISA and PCR) were quantified. Study 4: samples of intercostal and VL of 6 patients with severe sepsis and 6 control subjects were analyzed for muscle structure, oxidative stress and inflammatory mediators (above mentioned techniques). Results: Study 1: Basal levels of oxidative stress and antioxidants (SOD2) were increased in the VL versus the intercostal muscle of COPD patients. After 10 weeks of training, significant improvements were observed in exercise capacity and quality of life with no increases in oxidative stress in either of the two muscles. Study 2: The increase in the proportion of fast fibers in the VL of COPD patients was associated with increased mortality, especially in those with a severe disease. Study 3: Exercise limitation as well as increases in the percentage of fast fibers, signs of muscle damage, internalized nuclei and satellite cells was observed in the VL of COPD patients compared to controls. Furthermore, increased expression of genes involved in early stages of muscle regeneration (PAX7, MYOG and Myf6) but a decrease in those regulating late phases (MYH8) was also observed in the muscle of COPD patients when compared to controls. Patients with COPD and low weight also showed upregulation of the genes encoding IL-6 and muscle growth factors (IGF-1 and MGF). We saw no difference on primary myoblast cultures in either the ability of migration, proliferation, differentiation or the expression of key muscle regeneration genes between patients and controls. Study 4: Different oxidative stress and inflammatory (TNF- and its receptors, IL-1β, IL-6 and CD18) markers were increased in the VL of septic patients compared with controls, with no differences in the intercostal muscle. Conclusions: We found significant alterations in the muscles of both COPD and septic patients, although the latter had a distinct pattern between respiratory and peripheral muscles. High intensity training induces clinical improvement in COPD patients, with no increases in the levels of oxidative stress and inflammation. The mechanisms of muscle regeneration appear to be altered in the VL of COPD patients, which is probably due to the interaction of local factors in vivo. Muscle fiber phenotype predicts mortality of these patients.

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