TGFβ/KLF17/TPRX1 AXIS INSTATES HUMAN TOTIPOTENCY PROGRAM IN PLURIPOTENT STEM CELLS
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Director
Esteban Barragán, Miguel Ángel
Muñoz Cánoves, Pura
Muñoz Cánoves, Pura
Tutor
Muñoz Cánoves, Pura
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Publication Date
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131 p.
Embargo date
2027-12-23T01:00:00Z
License
Citation
Liu, H. TGFβ/KLF17/TPRX1 AXIS INSTATES HUMAN TOTIPOTENCY PROGRAM IN PLURIPOTENT STEM CELLS. Universitat Pompeu Fabra; 2025. handle: http://hdl.handle.net/10803/696661
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Citation
Doctoral program
Universitat Pompeu Fabra. Doctorat en Biomedicina
Abstract
La totipotència humana, l'estat cel·lular fonamental que possibilita l'especificació de llinatges embrionaris, s'enfronta a grans reptes de recerca: l'escassetat de material embrionari humà i importants preocupacions ètiques. L'establiment de cèl·lules similars a les de 8 cèl·lules (8CLCs)—que recapitulen característiques clau de l'embrió humà de 8 cèl·lules, incloent-hi el seu transcriptoma, epigenoma i potencial de diferenciació—proporciona un model potent per superar aquestes limitacions i estudiar la totipotència humana. No obstant això, els mecanismes regulators que governen la inducció de 8CLCs romanen elusius. Ací demostrem el paper crític de la senyalització TGFβ en impulsar la conversió de cèl·lules mare pluripotents (PSCs) naïf en 8CLCs. La inhibició química o la reducció genètica de la senyalització TGFβ (via SMAD2) va abolir la generació de 8CLCs, suprimint els marcadors de totipotència (TPRX1, DUXA, ZNF280A) mentre es preservaven els gens de pluripotència (POU5F1). L'anàlisi de RNA-seq de cèl·lules individuals va revelar que la inhibició de TGFβ va reduir les poblacions de 8CLC de l'11,1% al 0,36%, corroborat mitjançant FACS i immunofluorescència. Mecanísticament, l'unió de SMAD2 canvia de regions genòmiques associades a pluripotència a regions associades a totipotència, promovent l'accessibilitat de la cromatina. Com a downstream de la senyalització TGFβ, KLF17 va emergir com un efector clau, mantenint la totipotència mitjançant la supressió de la senyalització Wnt. La disminució de KLF17 va bloquejar la formació de 8CLC (0,62% vs. 14,1% de control), mentre que la seva sobreexpressió la va millorar i va rescatar l'efecte negatiu de la inhibició de TGFβ. Els perfils CUT&Tag i Co-IP van revelar que KLF17 facilita l'obertura de la cromatina en gens específics de 8 cèl·lules (específics-8C) i elements transposables reclutant EP300 per dipositar H3K27ac, una marca de promotors i potenciadors actius, i coopera amb TPRX1 en un bucle de reforç. En conjunt, TGFβ-KLF17 acobla la remodelació de la cromatina per activar la totipotència, proporcionant insights sobre l'embriogènesi humana i la reprogramació.
La totipotencia humana, el estado celular fundamental que permite la especificación de linajes embrionarios, enfrenta grandes desafíos de investigación: la escasez de material embrionario humano y preocupaciones éticas significativas. El establecimiento de células similares a las de 8 células (8CLCs), que recapitulan características clave del embrión humano de 8 células, incluidos su transcriptoma, epigenoma y potencial de diferenciación, proporciona un modelo poderoso para superar estas limitaciones y estudiar la totipotencia humana. Sin embargo, los mecanismos reguladores que gobiernan la inducción de las 8CLCs siguen siendo esquivos. Aquí demostramos el papel crítico de la señalización de TGFβ en impulsar la conversión de células madre pluripotentes ingenuas (PSCs) en 8CLCs. La inhibición química o la eliminación genética (knockdown) de la señalización de TGFβ (a través de SMAD2) abolieron la generación de 8CLCs, suprimiendo marcadores de totipotencia (TPRX1, DUXA, ZNF280A) mientras se conservaban los genes de pluripotencia (POU5F1). El secuenciación de ARN de células individuales (scRNA-seq) reveló que la inhibición de TGFβ redujo las poblaciones de 8CLC del 11,1% al 0,36%, lo que fue corroborado por citometría de flujo (FACS) e inmunofluorescencia. Mecanísticamente, la unión de SMAD2 cambia de regiones genómicas asociadas a la pluripotencia a regiones asociadas a la totipotencia, promoviendo la accesibilidad de la cromatina. Como efector aguas abajo de la señalización de TGFβ, KLF17 surgió como un efector clave, sosteniendo la totipotencia al suprimir la señalización de Wnt. El agotamiento de KLF17 bloqueó la formación de 8CLCs (0.62% vs. 14.1% del control), mientras que su sobreexpresión la potenció y rescató el efecto negativo de la inhibición de TGFβ. El perfilamiento CUT&Tag reveló que KLF17 facilita la apertura de la cromatina en genes específicos de 8 células (8C-específicos) y elementos transponibles mediante el reclutamiento de EP300 para depositar H3K27ac, una marca de promotores y potenciadores activos, y coopera con TPRX1 en un bucle de refuerzo. En conjunto, TGFβ-KLF17 orquesta un programa dual epigenético, acoplando el remodelamiento de la cromatina y la metilación del ARN para activar la totipotencia, proporcionando información clave sobre la embriogénesis y la reprogramación humana.
Human totipotency, the foundational cellular state enabling embryonic lineage specification, faces major research challenges: scarcity of human embryo material and significant ethical concerns. The establishment of 8-cell-like cells (8CLCs)—which recapitulate key features of the human 8-cell embryo, including its transcriptome, epigenome, and differentiation potential—provides a powerful model to overcome these limitations and study human totipotency. However, the regulatory mechanisms governing 8CLC induction remain elusive. Here, we demonstrate the critical role of TGFβ signaling in driving the conversion of naive pluripotent stem cells (PSCs) into 8CLCs. Chemical inhibition or genetic knockdown of TGFβ signaling (via SMAD2) abrogated 8CLCs generation, suppressing totipotency markers (TPRX1, DUXA, ZNF280A) while preserving pluripotency genes (POU5F1). Single-cell RNA-seq revealed TGFβ inhibition reduced 8CLC populations from 11.1% to 0.36%, corroborated by FACS and immunofluorescence. Mechanistically, SMAD2 binding shifts from pluripotency to totipotency-associated genomic regions, promoting chromatin accessibility. As the downstream of TGFβ signaling, KLF17 emerged as a key effector, sustaining totipotency by suppressing Wnt signaling. KLF17 depletion blocked 8CLC formation (0.62% vs. 14.1% control), while overexpression enhanced it and rescue the negative effect of TGFβ inhibition. CUT&Tag profiling and Co-IP revealed that KLF17 facilitates chromatin opening at 8-cell-specific (8C-specific) genes and transposable elements by recruiting EP300 to deposit H3K27ac, a mark of active promoters and enhancers, and cooperates with TPRX1 in a reinforcing loop. Collectively, TGFβ-KLF17 couples chromatin remodeling to activate totipotency, providing insights into human embryogenesis and reprogramming.
La totipotencia humana, el estado celular fundamental que permite la especificación de linajes embrionarios, enfrenta grandes desafíos de investigación: la escasez de material embrionario humano y preocupaciones éticas significativas. El establecimiento de células similares a las de 8 células (8CLCs), que recapitulan características clave del embrión humano de 8 células, incluidos su transcriptoma, epigenoma y potencial de diferenciación, proporciona un modelo poderoso para superar estas limitaciones y estudiar la totipotencia humana. Sin embargo, los mecanismos reguladores que gobiernan la inducción de las 8CLCs siguen siendo esquivos. Aquí demostramos el papel crítico de la señalización de TGFβ en impulsar la conversión de células madre pluripotentes ingenuas (PSCs) en 8CLCs. La inhibición química o la eliminación genética (knockdown) de la señalización de TGFβ (a través de SMAD2) abolieron la generación de 8CLCs, suprimiendo marcadores de totipotencia (TPRX1, DUXA, ZNF280A) mientras se conservaban los genes de pluripotencia (POU5F1). El secuenciación de ARN de células individuales (scRNA-seq) reveló que la inhibición de TGFβ redujo las poblaciones de 8CLC del 11,1% al 0,36%, lo que fue corroborado por citometría de flujo (FACS) e inmunofluorescencia. Mecanísticamente, la unión de SMAD2 cambia de regiones genómicas asociadas a la pluripotencia a regiones asociadas a la totipotencia, promoviendo la accesibilidad de la cromatina. Como efector aguas abajo de la señalización de TGFβ, KLF17 surgió como un efector clave, sosteniendo la totipotencia al suprimir la señalización de Wnt. El agotamiento de KLF17 bloqueó la formación de 8CLCs (0.62% vs. 14.1% del control), mientras que su sobreexpresión la potenció y rescató el efecto negativo de la inhibición de TGFβ. El perfilamiento CUT&Tag reveló que KLF17 facilita la apertura de la cromatina en genes específicos de 8 células (8C-específicos) y elementos transponibles mediante el reclutamiento de EP300 para depositar H3K27ac, una marca de promotores y potenciadores activos, y coopera con TPRX1 en un bucle de refuerzo. En conjunto, TGFβ-KLF17 orquesta un programa dual epigenético, acoplando el remodelamiento de la cromatina y la metilación del ARN para activar la totipotencia, proporcionando información clave sobre la embriogénesis y la reprogramación humana.
Human totipotency, the foundational cellular state enabling embryonic lineage specification, faces major research challenges: scarcity of human embryo material and significant ethical concerns. The establishment of 8-cell-like cells (8CLCs)—which recapitulate key features of the human 8-cell embryo, including its transcriptome, epigenome, and differentiation potential—provides a powerful model to overcome these limitations and study human totipotency. However, the regulatory mechanisms governing 8CLC induction remain elusive. Here, we demonstrate the critical role of TGFβ signaling in driving the conversion of naive pluripotent stem cells (PSCs) into 8CLCs. Chemical inhibition or genetic knockdown of TGFβ signaling (via SMAD2) abrogated 8CLCs generation, suppressing totipotency markers (TPRX1, DUXA, ZNF280A) while preserving pluripotency genes (POU5F1). Single-cell RNA-seq revealed TGFβ inhibition reduced 8CLC populations from 11.1% to 0.36%, corroborated by FACS and immunofluorescence. Mechanistically, SMAD2 binding shifts from pluripotency to totipotency-associated genomic regions, promoting chromatin accessibility. As the downstream of TGFβ signaling, KLF17 emerged as a key effector, sustaining totipotency by suppressing Wnt signaling. KLF17 depletion blocked 8CLC formation (0.62% vs. 14.1% control), while overexpression enhanced it and rescue the negative effect of TGFβ inhibition. CUT&Tag profiling and Co-IP revealed that KLF17 facilitates chromatin opening at 8-cell-specific (8C-specific) genes and transposable elements by recruiting EP300 to deposit H3K27ac, a mark of active promoters and enhancers, and cooperates with TPRX1 in a reinforcing loop. Collectively, TGFβ-KLF17 couples chromatin remodeling to activate totipotency, providing insights into human embryogenesis and reprogramming.
Keywords
Totipotència, Totipotency, Totipotencia, 8CLCs, 8CLCs, 8CLCs, Senyalització de TGFβ, TGFβ signaling, Señalización de TGFβ, KLF17, KLF17, KLF17, Factor de transcripció, Transcription factor, Factor de transcripción
Subjects
576 - Cellular and subcellular biology. Cytology
Publisher
Universitat Pompeu Fabra
