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Reconstitution of FMRP-mediated mRNA transport system in vitro

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dc.contributor.author Komissarov, Artem, 1992-
dc.contributor.other Maurer, Sebastian
dc.contributor.other Universitat Pompeu Fabra. Departament de Ciències Experimentals i de la Salut
dc.date.accessioned 2020-12-04T02:26:46Z
dc.date.available 2020-12-04T02:26:46Z
dc.date.issued 2020-10-07
dc.identifier http://hdl.handle.net/10803/670058
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/10230/45928
dc.description.abstract Learning and memory formation are based on the mechanisms of synaptic plasticity. Synaptic plasticity modulates development and strengthening of new neuronal connections, or synapses, upon learning and is based on local protein synthesis next to activated neuronal spines. Thousands of mRNA species are transported from the soma of neuron to dendrites, in order to be translated on demand. The mechanisms of this mRNA transport remain poorly understood. Mutations of Fragile X-mental retardation protein (FMRP) cause a spectrum of mental retardation disorders. Among other functions, FMRP mediates signal-mediated mRNA transport and local translation in dendrites. In multiple attempts to understand how FMRP is implicated in mRNA transport, there were identified few motor protein candidates. Besides controversy in the literature, none of these motor proteins was demonstrated to bind directly and transport FMRP. In my PhD studies, I employed in vitro reconstitution assays, coupled to Total Internal Reflection (TIRF) microscopy, to test, which of the proposed candidate motors can transport FMRP along the microtubules and whether FMRP can co-transport mRNA molecules. In order to understand the biochemistry of FMRP-mediated mRNA transport, I have purified and tested motor proteins from three Kinesin subfamilies. In this PhD thesis, I am reporting that FMRP binds directly to and is transported by Kinesin-2 motor (KIF3A/C heterodimer), but not by the other tested motors. Mutational analysis of FMRP suggests that its C-terminal region plays the biggest role in Kinesin-2 binding, and that this interaction does not depend on the RGG box region, known to recognise the G-quadruplex structure of FMRP’s mRNA targets. These results suggest that mRNA and motor binding by FMRP are not mutually exclusive, and thus FMRP must be capable to mediate mRNA transport. I also show that KIF3A/C motor binds several mRNA targets, with and without G-quadruplex structure, and that G-quadruplex mRNA competes with FMRP for motor binding. These results raise many questions that I address in the Discussion part of the thesis. This work is the first of its kind, to my knowledge, to systematically test kinesin motor proteins for direct interaction with FMRP and to reconstruct an FMRP transport complex. I conclude that FMRP binds directly to the Kinesin-2 motor and that this complex moves processively along the microtubules. This complex is still missing its cargo, mRNA, which will be investigated beyond the scope of this PhD thesis. I analyse the speeds of used kinesin motors and compare them to the literature. In the end, I discuss possible reasons why FMRP was not binding the G-quadruplex mRNA in my experimental conditions and outline the caveats of in vitro reconstitution assays.
dc.description.abstract El aprendizaje y la formación de la memoria se basan en los mecanismos de plasticidad sináptica. La plasticidad sináptica modula el desarrollo y el fortalecimiento de nuevas conexiones neuronales, o sinapsis, al aprender y se basa en la síntesis local de proteínas al lado de las espinas neuronales activadas. Miles de especies de ARNm son transportadas desde el soma de la neurona a las dendritas, para ser traducidas bajo demanda. Los mecanismos de este transporte de ARNm siguen siendo poco conocidos. Las mutaciones de la proteína Fragile X-mental Retardation (FMRP) causan un espectro de trastornos de retraso mental. Entre otras funciones, FMRP media el transporte de ARNm inducido por señal y la traducción local en las dendritas. En múltiples intentos de comprender cómo FMRP está implicada en el transporte de ARNm, se identificaron algunos candidatos de proteínas motoras. Además de la controversia en la bibliografía, no se demostró que ninguna de estas proteínas se uniera directamente y transportara FMRP. En mis estudios de doctorado, he utilizado ensayos de reconstitución in vitro, junto con la microscopía de reflexión interna total (TIRF), para probar cuál de los motores candidatos propuestos puede transportar FMRP a lo largo de los microtúbulos y si FMRP puede co-transportar moléculas de ARNm. Para comprender la bioquímica del transporte de ARNm mediado por FMRP, he purificado y probado proteínas motoras de tres subfamilias de kinesina. En esta tesis doctoral, presento que FMRP se une directamente y es transportada por el motor Kinesin-2 (heterodímero KIF3A/C), pero no por los otros motores probados. El análisis de mutaciones de FMRP sugiere que su región C-terminal juega el papel más importante en la unión con Kinesin-2, y que esta interacción no depende de la región de RGG box, conocida por identificar la estructura de G.quadruplexde de los ARNm diana de FMRP. Estos resultados sugieren que FMRP es capaz de unirse al motor y transportar ARNm simultáneamente. También muestro una observación de que el motor KIF3A/C se une a varios ARNms, con y sin estructura de G-quadruplex, y que el ARNm con G-quadruplex compite con FMRP por la interacción con la proteína motora. Estos resultados plantean muchas preguntas que abordo en la parte de Discusión de esta tesis. Este trabajo es el primero de su tipo, en mi conocimiento, para probar sistemáticamente la interaccion directa de FMRP con las proteínas motoras de kinesina y para reconstruir un complejo de transporte de FMRP. Concluyo que FMRP se une directamente al motor Kinesin-2 y que este complejo se mueve procesivamente a lo largo de los microtúbulos. A este complejo todavía le falta su carga, ARNm, que se investigará más allá del alcance de esta tesis doctoral. Analizo las velocidades de los motores de kinesina utilizados ​​y los comparo con la bibliografía. Al final, discuto las posibles razones de por qué FMRP no se estaba uniendo el ARNm de G-quadruplex en mis condiciones experimentales y describo los escollos en utiliza de los ensayos de reconstitución in vitro.
dc.format application/pdf
dc.format 130 p.
dc.language.iso eng
dc.publisher Universitat Pompeu Fabra
dc.rights L'accés als continguts d'aquesta tesi queda condicionat a l'acceptació de les condicions d'ús establertes per la següent llicència Creative Commons: http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/
dc.rights info:eu-repo/semantics/openAccess
dc.source TDX (Tesis Doctorals en Xarxa)
dc.title Reconstitution of FMRP-mediated mRNA transport system in vitro
dc.type info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
dc.type info:eu-repo/semantics/publishedVersion
dc.date.modified 2020-12-02T17:11:05Z
dc.subject.keyword Fragile X-mental retardation protein (FMRP)
dc.subject.keyword In vitro reconstitution
dc.subject.keyword Kinesin-2
dc.subject.keyword Neuron
dc.subject.keyword Reconstitución in vitro
dc.subject.keyword Neurona
dc.subject.keyword 616.8


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