Investigating the role of Wnt/β-catenin pathway in pluripotency and somatic cell reprogramming

Abstract

The adaptive response of cells to external stimuli is an intriguing mechanism at the basis of the existence of life itself. For this purpose, signalling pathways and gene regulatory networks elegantly evolved translating extracellular signals into finely tuned cellular responses. Among them, the Wnt/ß-catenin signalling pathway converges on the regulation of ß-catenin protein, which, in turn regulates target gene expression. In particular the Wnt/ß-catenin pathway plays a pivotal role in sustaining pluripotency and somatic cell reprogramming. Here we identified a temporal of Wnt/ß-catenin activity during somatic cell reprogramming, controlling the expression levels of mesenchymal-to-epithelial transition and senescence-associated genes through TCF1. We demonstrated that the “Wnt-OFF” state is an early reprogramming marker and that dynamic modulation can be effectively used to increase the reprogramming efficiency. Furthermore the Wnt/ß-catenin pathway is a key regulator of pluripotency and self-renewal of mouse embryonic stem cells (mESCs) and a small-molecule activator of the Wnt pathway is widely used to maintain embryonic stem cells in a ground state of pluripotency. The role of ß-catenin in mESCs is however still controversial. We noticed available ß-catenin knock-out models are flawed by the production of N-terminally truncated proteins with unknown functions. We therefore generated a novel ß-catenin knock-out using CRISPR/Cas9 technology, hoping to have clearer insight of ß-catenin functions in mESCs. We have also found that ground state pluripotency promoted by sustained Wnt pathway activation cannot be maintained indefinitely, resulting in a “lapsed” ground state possibly due, among other factors, to regulatory negative feedback loops that impair Wnt/ß-catenin activity.

La respuesta adaptativa de las células a estímulos externos es un mecanismo fundamental de la existencia de la vida en sí misma. Para este fin, rutas de señalización y redes de regulación génica evolucionaron elegantemente, traduciendo señales extracelulares en respuestas celulares calibradas con precisión. Entre ellas, la ruta de señalización de Wnt/ß-catenin converge en la regulación de la proteína ß-catenin, que a su vez regula la expresión de genes diana. En particular, la ruta de Wnt/ß-catenin tiene un rol fundamental en el mantenimiento de la pluripotencia y la reprogramación de células somáticas. En esta tesis hemos identificado un papel temporal de actividad de Wnt/ß-catenin durante la reprogramación de células somáticas, lo que controla los niveles de expresión de genes asociados a transición mesenquima-epitelial y senescencia a través de TCF1. Además, la ruta de Wnt/ß-catenin es un regulador clave de la pluripotencia y la auto-renovación de células madre embrionarias de ratón (mESCs). Una pequeña molécula, activadora de la ruta Wnt es usada comúnmente para mantener las células madre embrionarias en “ground state” de pluripotencia. Sin embargo, el rol de la ß-catenin en las mESCs es aún controvertido. Observamos que los modelos disponibles de Knock-Out de ß-catenin producen proteínas truncadas en N-terminal con funciones desconocidas. Por ello, generamos un nuevo Knock-Out usando CRISPR/Cas9, al fin de clarificar funciones de ß-catenina en mESCs. Hemos encontrado también que el “ground state” de pluripotencia promovido por la activación sostenida de Wnt no puede ser mantenido indefinidamente, resultando esto en un“ lapsed ground state”; debido posiblemente, entre otros factores, a feedback-loop negativos que afectan negativamente la actividad de Wnt/ß-catenin.

Programa de doctorat en Biomedicina