In utero exposure to xenoestrogens, associated health outcomes and epigenetic mechanisms in children

Abstract

The prenatal period is a stage of special sensitivity to the adverse effects of environmental agents for the developing fetus. The human placenta is an organ that, in the interface between mother and fetus, plays a key role in fetal growth and development and, as such, affects the fetal programming underlying subsequent disease vulnerability in adulthood. There is increasing epidemiological evidence linking prenatal exposure to endocrine disrupting chemicals (EDCs) and adverse health outcomes in children, although mechanisms remain still unclear. Xenoestrogens are a group of endocrine disrupting chemicals that target the estrogenic signaling pathway and include a large number of compounds, both man-made and of natural origin, ubiquitously present in the environment, often at low doses. Xenoestrogen exposure has been related both in humans and in animal models to adverse health endpoints, most especially obesity and metabolic disorders, reproductive problems, increased risk for several types of cancers and neurobehavioral abnormalities. Prenatal epigenetic dysregulation has been proposed as a possible causal mechanism. The main objective of this thesis has been to evaluate the effects of prenatal exposure to mixtures of xenoestrogens on growth related and neuropsychological outcomes in children from the prospective Spanish birth cohort study INMA, INfancia y Medio Ambiente (Childhood and the Environment) Project, and to analyze whether in utero exposure to mixtures produces changes in placental DNA methylation, both globally or at specific genes and/or nearby regions. For that purpose, the Total Effective Xenoestrogen Burden (TEXB-alpha), a biomarker of the cumulative exposure to xenoestrogens, was measured in placental tissue using the E-Screen biossay. Information on birth outcomes was recorded by pediatricians or nurses at birth and at following time points, and neuropsychological assessment was conducted by trained psychologists using two different scales when children were around 2 and 4 years of age. DNA methylation was measured on DNA extracted from placenta for a sub-group of children using quantitative methods. We evaluated global DNA methylation by bisulfite pyrosequencing of several retrotransposons (repetitive elements that make up around 42% of the human genome); and genome-wide DNA methylation was scanned with a comprehensive array provided by Illumina, the HumanMethylation450 BeadChip, in which practically all human genes and many regulatory regions are represented. Associations were tested using linear regression, mixed-effects regression or robust linear regression models accordingly, always adjusting for potential confounders and sex specific effects were investigated. Overall, we found significant associations between TEXB-alpha exposure in boys but not in girls and the outcomes studied: higher TEXB-alpha levels were associated with increasing birthweight and with a decrease in motor performance at age 1-2 years, which did not persist at age 4. Additionally, we found some evidence that xenoestrogen exposure produced a decrease in placenta global DNA methylation in an Alu element in boys and, although non-significant after multiple testing correction, induced changes in DNA methylation in boys in CpG sites located in several genes (i.e. LRPAP1, HAGH, PPARGC1B,KCNQ1 and KCNQ1DN), previously associated either to birthweight and Type 2 Diabetes, obesity or to steroid hormone metabolism and signalling. Results from this work on chidren from the general Spanish population suggest that low-level exposure to mixtures of hormonally active estrogenic compounds may produce growth-related changes and some adverse effects on the early development of motor tasks in the male population, and are suggestive of epigenetic disruption in global methylation in the same group, while the association with specific genes in boys remains unclear and needs to be evaluated in larger samples and using alternative methods. This thesis has analyzed for the first time in an epidemiological study a biomarker of exposure to mixtures of xenoestrogens in placenta in relation to birthweight, children growth, body mass index and neuropsychological development, adding knowledge to the limited evidence that prenatal xenoestrogen exposure could be relevant in terms of children health outcomes, that epigenetic alterations may play a mechanistic role and highlights the importance to take into account possible sex-related vulnerability to EDCs during pregnancy.

El període prenatal és una etapa sensible als efectes de l’exposició a agents ambientals. La placenta humana, un òrgan que comunica la mare i el fetus i que, durant aquest període, juga un paper clau en el creixement i el desenvolupament fetal. Com a tal, la placenta podria estar implicada en alteracions fenotípiques ja visibles en la infància i amb possibles efectes en salut a llarg termini. Existeix evidència epidemiològica que relaciona l’exposició prenatal a pertorbadors endocrins (EDCs, de l’ anglés endocrine disrupting chemicals) amb diferents indicadors de salut infantil, tot i que els mecanismes d’acció són encara poc coneguts. Els xenoestrògens són un grup d’EDCs que interfereixen amb les vies de senyalització de les hormones estrogèniques. Inclouen un ampli ventall de compostos, alguns d’origen natural i d’altres sintètic, omnipresents en el medi ambient, sovint a baixes concentracions. Un nombre important d’estudis científics han trobat associacions, tant en humans com en models animals, entre l’exposició prenatal a aquests compostos i alteracions metabòliques, obesitat, problemes reproductius, un augment de risc de patir diferents tipus de càncer i alteracions en el desenvolupament de funcions neuropsicològiques. Un possible mecanisme molecular proposat per molts investigadors que podria explicar, almenys en part, aquestes associacions és l’alteració de patrons epigenètics durant el període prenatal. L’objectiu principal d’aquest projecte de tesi ha estat avaluar l’associació entre l’exposició prenatal a mescles de compostos xenoestrogènics i el pes al naixement, la velocitat de creixement durant els 6 primers mesos i l’índex de massa corporal als 14 mesos, així com el desenvolupament neuropsicològic a diferents edats en nens de la cohort espanyola de naixement INMA (INfància i Medi Ambient), i també estudiar si aquesta exposició produeix canvis en la metilació del DNA en la placenta, a nivell global i/o en gens específics o possibles regions reguladores del genoma. Amb aquest propòsit, vam mesurar en placenta l’efecte estrogènic degut a mescles de compostos ambientals mitjançant un biomarcador anomenat Total Effective Xenoestrogen Burden (TEXB-alfa) usant l’assaig E-Screen, basat en la proliferació de cèl.lules tumorals MCF que responen a estrògens. La informació referent al pes al néixer i altres variables de creixement va ser recollida per pediatres i/o infermeres i l’avaluació neuropsicològica va ser realitzada per psicòlegs entrenats amb experiència prèvia en l’administració de les dues escales utilitzades. En un subgrup de nens, es va analitzar la metilació del DNA en placenta amb diferents mètodes quantitatius. A nivell global la vam estimar mesurant el percentatge de citosines metilades en unes seqüències repetides que constitueixen fins a un 42% del total del genoma humà anomenades retrotransposons usant la tècnica de piroseqüenciació i, per altra banda, es van mesurar els nivells de metilació de forma quantitativa en un gran nombre de citosines distribuïdes al llarg de tot el genoma, incloent pràcticament tots els gens descrits i moltes regions reguladores, amb un array produït per la casa comercial Illumina anomenat HumanMethylation450 BeadChip. Les corresponents associacions van ser analitzades usant models de regressió lineals, models de regressió lineal mixta (per a tenir en compte mesures repetides o correlacionades) i regressions lineals robustes, ajustant per potencials variables confusores. En tots els casos es va estudiar l’existència d’efectes diferents en funció del sexe dels nens. Els resultats obtinguts en aquesta tesi mostren l’existència d’associacions entre l’exposició prenatal a TEXB-alpha i els diferents fenotips estudiats en els nens però no en les nenes: en aquests, nivells alts de TEXB-alpha es relacionaven amb un augment significatiu del pes al néixer i alteracions neuropsicològiques, concretament una disminució en les puntuacions de l’escala motora al voltant dels 2 anys, tot i que aquest últim efecte ja no el trobàvem als 4 anys d’edat. També vam observar una disminució en els nens amb nivells alts de TEXB-alpha en la metilació en placenta d’un element repetitiu anomenat AluYb8, que representa un indicador de la metilació global del genoma i, tot i no ser significatius a nivell estadístic, vam trobar canvis en la metilació en nens en uns CpGs situats en gens (LRPAP1, HAGH, PPARGC1B, KCNQ1 i KCNQ1DN) que en estudis anteriors s’havien relacionat amb el pes al néixer, la obesitat, la diabetis de tipus II i el metabolisme i la resposta a hormones esteroides com l’estrògen. Aquests resultats, obtinguts en població general infantil espanyola, suggereixen que l’exposició constant i a baixes dosis a mescles de compostos actius a nivell hormonal podrien afectar el creixement i tenir un impacte en el desenvolupament inicial de funcions cerebrals en la població masculina, i aporten evidència de canvis en els nivells de metilació global en aquesta població, mentre que les associacions observades en relació a gens concrets són incertes i caldran més estudis en altres cohorts més nombroses i validacions tècniques usant altres mètodes. Finalment, aquesta tesi ha realitzat per primer cop un estudi epidemiològic usant un biomarcador d’exposició conjunta a mescles de xenoestrògens en placenta en relació a variables de creixement i desenvolupament neuropsicològic, i aporta nou coneixement a l’evidència científica existent, tot i que limitada, de què l’exposició prenatal a xenoestrògens pot tenir un impacte en la salut infantil, que alteracions en la metilació del DNA podrien jugar un paper mecanístic en aquests efectes observats i, finalment, destaquen la importància d’estudiar la possible vulnerabilitat diferencial entre nens i nenes a l’exposició in utero a pertorbadors endocrins.

Programa de doctorat en Biomedicina