C/EBPα poises B cells for rapid reprogramming into induced pluripotent stem cells

Abstract

One of the major goals of current stem cell research is understanding the mechanism of somatic cell reprogramming by Oct4, Sox2, Klf4 and Myc (OSKM) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). However, the finding that only a small proportion of the cells become reprogrammed, typically requiring >12 days, has hampered progress towards this goal. C/EBPα is a transcription factor specifically expressed in myelomonocytic cells within the hematopoietic system whose forced expression in B cells efficiently induces transdifferentiation into macrophages. We have now found that an 18-hour pulse of C/EBPα expression followed by OSKM activation induces an approximately 100-fold increase in the iPSC reprogramming efficiency, involving up to 95% of the cells within a week. Concomitantly, the cells undergo an epithelial-mesenchymal transition and pluripotency genes become upregulated to levels comparable to embryonic stem and iPS cells. In serum-free conditions the process is further accelerated, with 60% of the poised and OSKM induced B cells becoming Oct4-GFP positive within 2 days. These results are consistent with the idea that the C/EBPα pulse helps to overcome the stochastic phase of iPSC reprogramming. In addition, our work shed new light on the role of C/EBPα in induced pluripotency. Our data indicate that C/EBPα acts as a pathbreaker, at least in part mediated by the dioxygenase Tet2. C/EBPα binds to the Tet2 gene, induces its expression and translocates the protein to the nucleus. Here Tet2 binds to regulatory regions of pluripotency genes and converts methylated cytosine residues into hydroxymethylated cytosines. The pulse also renders the chromatin at regulatory sites of pluripotency genes accessible to DNase I digestion and, following OSKM induction, leads to local demethylation and to the binding of Oct4, correlating with the observed rapid upregulation of pluripotency genes. In line with an important role of Tet2 as a mediator of reprogramming, coexpression of the gene with OSKM enhanced B cell reprogramming substantially. The rapid and highly efficient iPSC reprogramming approach described herein should help to fully elucidate the early events of reprogramming to pluripotency and, if applicable to human cells, could have potential clinical applications.

Actualmente uno de los principales objetivos de la investigación con células madre es la comprensión de los mecanismos por los cuales las células somáticas se pueden reprogramar a células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) por la acción de los factores de transcripción Oct4, Sox2, Klf4 y Myc (OSKM). Sin embargo, la baja eficiencia de este proceso, que tiene lugar sólo en un pequeño porcentaje de células y que típicamente requiere más de 12 días para llevarse a cabo, ha impedido la consecución de grandes avances en este campo en los últimos años. C/EBPα es un factor de transcripción específico de células del linaje mielo-monocítico del sistema hematopoyético. La expresión ectópica de esta proteína en células B puede inducir su transdiferenciación a macrófagos. En nuestro estudio de investigación hemos descubierto que la exposición de C/EBPα durante 18 horas seguida de la activación de OSKM, aumenta en 100 veces la eficiencia de reprogramación de las iPSC, resultando en la reprogramación del 95% de las células después de una semana. En detalle, durante este proceso de reprogramación las células experimentan una transición epitelio-mesénquima y los genes de pluripotencia se expresan en niveles comparables a los expresados en células madre embrionarias y iPSC. Cuando la reprogramación se lleva a cabo en medio de cultivo sin suero el proceso es aún más rápido, de tal modo que el 60% de las células B inducidas por C/EBPα y OSKM son positivas para Oct4-GFP en tan sólo dos días. Estos resultados apoyan la idea de que una exposición transitoria de C/EBPα ayuda a superar la fase estocástica de la reprogramación de las iPSC. Además, nuestros descubrimientos aclaran el papel de C/EBPα en el proceso de pluripotencia inducida, indicando que actúa como un catalizador, mediado en parte por la actividad de la dioxigenasa Tet2. De tal modo, que C/EBPα se une a regiones reguladoras del locus de Tet2, induciendo de esta manera su expresión y translocando la proteína al núcleo. Una vez en el núcleo, Tet2 se une a las regiones regulatorias de los genes de pluripotencia y convierte los residuos de citosinas metilados existentes en estas regiones en citosinas hidroximetiladas. Además, la exposición transitoria de C/EBPα deja la cromatina más accesible a la digestión con DNasa I alrededor de las regiones regulatorias de los genes de pluripotencia y, tras la inducción con OSKM, desencadena una demetilación local favoreciendo la posterior unión de Oct4 a estas regiones. Todo ello finalmente promueve la expresión concomitante de los genes de pluripotencia. Adicionalmente, en nuestro estudio se demuestra que la coexpresión de Tet2 y OSKM aumenta significativamente la reprogramación de las células B, lo cual se encuentra en línea con un papel importante de Tet2 en la reprogramación. En resumen, en este estudio se presenta el sistema de reprogramación de iPSC más rápido y eficiente descrito a día de hoy. El cual, facilitará la comprensión de los eventos precoces en el proceso de reprogramación a pluripotencia y, en el caso de que se pueda extrapolar a células humanas, podrá tener aplicaciones clínicas relevantes en el campo de la medicina regenerativa.

Programa de doctorat en Biomedicina